Kalite Kontrol

Related image

Bir tüp bebek laboratuvarı için kalite kontrol, gerek laboratuvar içi gerek laboratuvarlar arasında başarıyı belirleyen en önemli ayırt edici faktördür

Tüp bebek laboratuvarları, özellikle embriyoloji laboratuvarı, embriyonik gelişimin rahim dışında(in vitro) gerçekleştirildiği yani kadın bedeninin ve rahimin düzenleyici ve koruyucu etkisinden uzak suni bir ortam olması nedeniyle çok yüksek hassasiyette yönetilmesi gereken yerlerdir. Embriyoların laboratuvarda kültürü sürecinde zarar görmemeleri ve başarılı bir gelişim sağlanabilmesi için fizyolojik ortamın sağladığı besleyici maddeler, sıcaklık, pH, sterilizasyon(bakteri, virüslerden koruma), yabancı organik ya da inorganik zararlı maddelerden koruma, ultraviole ışınları ve elektromanyetik dalgalardan koruma gibi hayati şartların birebir sağlanması için uygun koşulların varlığını teyit edecek bir kalite kontrol (Quality Control-QC) ve bu koşulların aynı kalitede devamlılığını garanti eden bir kalite güvence(Quality Assurance-QA) sistemi başarılı bir laboratuvar yönetimi için şarttır.

Embriyoloji laboratuvarında kalite kontrol 4 başlık altında yürütülür;

  • Kültür ortamı
  • İnkübasyon koşulları
  • Plastik sarf malzemeleri
  • Çevresel koşullar

Kültür ortamı:

Embriyo kültüründe bu amaç için özel olarak üretilmiş ve gerekli kalite kontrol testleri (pH, Osmolarite, Sterilite testi, MEA-mouse embryo assay, LAL endotoxin test) yapılmış hazır solüsyonlar kullanılmaktadır. Bu solüsyonların ortak noktaları, embriyoların gelişim sürecinde ihtiyaç duyacakları enerji kaynakları (piruvat, glikoz), yapıtaşları (aminoasitler), pH tamponları (bikarbonat) ve mineraller ile destekleyici bileşenleri (EDTA, albumin) içermesidir. Kalite kontrol testlerinden en önemlisi MEA-Mouse Embryo Assay’dir. Bu testte, test edilen ilgili kültür solüsyonu lotunda (bir partide üretilen kısım) döllenmiş fare embriyoları blastokist aşamasına kadar kültüre edilerek blastokiste gidiş oranı hesaplanır. Döllenmiş yumurtaların %80’den fazlasının blastokiste ulaşması testi geçmek için yeterli eşik değerdir. İkinci önemli test olan LAL-Endotoxin testidir. Endotoxinler gram negatif bakterilerin hücre zarlarında bulunan lipopolisakkarid yapılardır ve bu yapıların kültür ortamında bulunması, çoğunlukla embriyo kültürü sürecinde etkisi gözlenmese de, embriyonun implantasyonunu ciddi oranda olumsuz etkileyebilmektedir. LAL-limulous amoebocyte lysate, atnalı yengeci(horseshoe crab) olarak bilinen bir yengeç türünün bağışıklık sistemi yapısında bulunan bir enzimdir. Bu enzimler, ortamda bulunan endotoxinlere bağlanıp pıhtı benzeri yapılar oluşturarak etkisiz hale getirirler. Endotoxin unit-EU olarak tanımlanan bu yapıların solüsyonun mililitresinde 0.5’ten az olması (<0.5 EU/ml) )testi geçmek için yeterli eşik değerdir.

Kaliteli bir laboratuvar yönetimi için solüsyonların belirtilen şartları sağlaması tek başına yeterli değildir. Bu kültür solüsyonları içerisindeki embriyoların inkübe edileceği inkübatörlerin sıcaklık ve karbondioksit gazı değerlerinin, solüsyon içerisinde, embriyo için hayati önemi olan, pH değerini optimize edecek şekilde ayarlanması şarttır. Üreticilerin pH için uygunluk değeri olarak verdikleri 7.2-7.4 aralığı çok geniş bir aralıktır. Örnek olarak laboratuvarımızda 7.24-7.28 aralığı ideal embriyo gelişimi için en uygun değer olarak belirlenmiştir. Her embriyo kültür solüsyonu lotu değişiminde ve her lotun kullanım sürecinde yapılan düzenli kontroller ile pH’ın bu seviyede olduğu teyit edilmektedir.

Laboratuvarımızda pH ölçümü için mevcut en son teknoloji olan SafeSense ölçüm cihazı kullanılmaktadır. Bu cihaz optik floresan ölçüm teknolojisi ile çalışmakta ve inkübatör içine yerleştirilen fiberoptik sensörü vasıtasıyla, sensöre yerleştirilen kültür solüsyonunun pH’sını ve 1 haftalık süreçte izleme özelliği ile de kültür sürecindeki olası pH değişimlerini saptayabilmekjtedir.

İnkübasyon koşulları:

Embriyoloji laboratuvarında, kültür solüsyonu içerisindeki embriyolar, inkübatör adı verilen ve kültür sürecinde gerekli olan sıcaklık, nem ve karbondioksiti sağlayan cihazlarda bekletilirler(inkübasyon). Kültür ortamının sıcaklığı kültür süresince 37 derecede sabit tutulmalıdır. Fizyolojik seviye olan 37 derece embriyonun, protein yapısındaki ısıya hassas enzimlerin büyük rol oynadığı metabolik faaliyetlerinin düzgün yürütülmesi ve mikrotübül adı verilen, hücre iskeletini oluşturan, hücre içinde taşıma faaliyetlerini ve en önemlisi hücre bölünmesini yöneten protein yapılarının da düzenli faaliyeti açısından hayati önemdedir. Bu sıcaklık aynı zamanda pH seviyesinin sabitlenmesi açısından da önemlidir.

Karbondioksit, pH seviyesini belirleyen en önemli değişkendir. Kültür solüsyonu içerisindeki çözünmüş karbondioksit, kandakine benzer şekilde asitliği düzenleyen bikarbonat tampon sistemini etkileyerek ortamın asiditesini değiştirir. Birçok kültür solüsyonu üreticisinin önerdiği %6 karbondioksit oranı çoğu durumda yeterli olmamakta, farklı kültür solüsyonları ve herbir solüsyon lotu arasında bikarbonat oranındaki ufak  değişimler ve ayrıca solüsyon içerisinde çözünmüş karbondioksit seviyesini etkileyen, laboratuvarın deniz seviyesinden yüksekliği ayrıca dikkate alınmalı ve karbondioksit seviyesi mutlaka pH ölçümlerine göre ayarlanmalıdır.

Son yıllarda yapılan çalışmalar, inkübasyon ortamındaki oksijen oranınında embriyo gelişimi üzerinde etkisi olduğunu göstermiş ve rahim içerisinde ölçülen ortalama seviye olan %5 oksijen oranını sağlayan inkübatörler kullanılmaya başlanmıştır. Bu konuda yapılan bilimsel çalışmalar, düşük oksijen oranının, gebelik başarısına etkisi olmamakla birlikte, gelişen blastokist oranını arttırıcı etkisi olduğunu göstermiştir.  Laboratuvarımızda da bu özellikte inkübatörler kullanılmaktadır.

İnkübatörler için kullanılan gazların kalitesi de önemli bir etkendir. Kullanılan gazlar mutlaka medikal kullanıma uygun, %99.9 saflıkta olmalıdır. Ayrıca gazlar içindeki olası mikro partiküller ve VOC(volatile organic compounds) olarak tanımlanan zararlı uçucu organik bileşiklerin inkübatöre girişinin engellenmesi için gaz hattında in-line filtre olarak tanımlanan özel filtrelerin kullanılması gerekmektedir. Bu filtrelerin kullanım ömürleri 6 aydır ve bu periyotta değişimi gereklidir. Laboratuvarımızda her inkübatörde bu özellikte inline filtreler kullanılmaktadır.

İnkübatör içerisindeki koşulların uygunluğunu kontrol etmek için sadece cihazın göstergesindeki değerlere güvenilmesi doğru bir yaklaşım değildir. Mutllaka harici ölçüm cihazları ile düzenli ölçümü ve gerekli görülmesi halinde kalibrasyonu(olası sapmaların düzeltilmesi) gereklidir. Laboratuvarımızda tüm inkübatör parametreleri harici ölçüm cihazı ile günlük olarak ölçülüp kaydedilmektedir.  Ek olarak, inkübe edilen kültür solüsyonlarının pH ölçüm değerleri de inkübatör karbondioksit seviyesinin belirlenmesi ve kalibrasyonu için kullanılmaktadır.

Plastik sarf malzeme:

Laboratuvarda gamet hücreleri ile yapılan işlemler (sperm hazırlığı, OPU, ICSI) ve özellikle embriyo kültürü için kullanılan sarf malzemelerin uygunluğu çok önemli ve maalesef ülkemizde en çok gözardı edilen faktördür.  Bu malzemeler arasında kültür kapları, tüpler, serolojik pipetler ve flasklar sayılabilir. Bu malzemeler dünya çapında halihazırda biyokimya ve mikrobiyoloji gibi laboratuvarlarda yoğun olarak kullanılmakta ve bu nedenle de ucuza temin edilebilmektedir. Fakat aynı malzemelerin tüp bebek laboratuvarlarında güvenli kullanımı için uygunluğunun test edilmeli ya da bu amaçla özel olarak üretilmiş ve uygunluk testleri yapılmış olmalıdır. Bu kalite kontrol testlerinin uygulanması ise malzemelerin maliyetini arttırmaktadır.

Bu malzemelerin uygunluğu için tercih edilen en ideal test, kültür solüsyonları içinde kullanılan MEA-Mouse Embryo Assay’dir. Kültür solüsyonları için kullanılan eşik değerlerin aynısı geçerlidir. İdeal embriyo kültür şartları için hücrelerin ve kültür solüsyonlarının temas ettiği tüm malzemeler mutlaka MEA uygulanmış ve onaylanmış olmalıdır. Merkezimizde tüm aşamalarda bu koşullara sahip malzemeler kullanılmaktadır.

Çevresel koşullar:

Laboratuvarda tüm hazırlık işlemleri tamamen steril bir ortam sağlayan özel çalışma kabinleri içerisinde (Class II laminar air flow cabinet) gerçekleşitirilse de, örnekler taşıma esnasında, mikroenjeksiyon sürecinde, embriyo kontrollerinde ve inkübatörlerin kapı açılışlarında ortam havasına maruz kalmaktadır. Her ne kadar tüp bebek laboratuvarlarında ortam havalandırmasının HEPA(High Efficiency Particulate Arrestance-yüksek etkinlikte partikül tutma) filtreler aracılığıyla filtrelenmesi zorunlu olsa da, bu filtreler havalandırma yoluyla gelebilecek uçucu kimyasal ve organik bileşikleri engellemek için yeterli değildir ve farklı yapıda filtrasyon cihazlarının kullanımı gerekmektedir.  Günlük işleyiş esnasında laboratuvar içerisinde oluşabilecek partiküller ve laboratuvarın sıcaklık ve nem seviyeleri de kontaminasyon riski açısından önemlidir. Çevresl koşullar içerisinde en önemlisi ise hücreler ile çalışılan yüzeylerin sıcaklıklarının kontrol altında tutulmasıdır. Bu koşulları detaylı olarak incelersek;

Hava kalitesi:

Laboratuvar havalandırması hastaneden bağımsız bir havalandırma/iklimlendirme sistemi (HVAC-Heating Ventilation Air Conditioning) tarafından sağlanmalıdır. Sistemde, özellikle hava kirliliğinin yoğun olduğu şehir içi lokasyonlarda, dış havanın laboratuvara girişi öncesinde HEPA ve karbon filtreleri ile temizlenmesi şarttır. Sistemin hava veriş ve çekiş ayarları embriyoloji laboratuvarı içerisinde, “pozitif basınç” olarak tanımlanan, havanın daima laboratuvardan bağlantılı odalara (OPU, androloji, yarı steril koridorlar) doğru hareket edeceği şekilde düzenlenmelidir. Böylece diğer odalardan embriyoloji laboratuvarına hava yoluyla herhangi bir kirletici etkenin taşınması engellenmiş olur. Ek olarak laboratuvar sıcaklığı 21-25 derece ve nem %30-50 aralığında tutulmalıdır. Bu oranlar laboratuvar yüzeylerinde oluşabilecek bakteriyel kontaminasyonları sınırlamak açısından önemlidir. Havalandırma sistemi ve laboratuvar içerisinde kullanılan filtreler şunlardır;

Aktif karbon filtreler: İçeriğinde granül ya da toz halde aktif karbon kömürü bulunan filtrelerdir. Geniş iç gözenek yapısı ve kimyasal aktif bağlanma özelliği ile havadaki kirletici molekül ve iyonlara bağlanarak etkisiz hale getirirler. Havanın kirlilik seviyesine bağlı olarak değişen doygunluk süreleri nedeniyle efektif kullanım için düzenli olarak değişimleri gerekmektedir.

HEPA filtreler: Standart olarak 0.3 mikrometreden küçük partikülleri %99.7 oranında tutma özelliğine sahip filtrelerdir. Laboratuvar havalandırması ve steril çalışma kabinlerine giren havanın filtrasyonu için kullanılırlar. Bilinen en küçük bakteri olan mikoplazmaların boyutları 0.2-0.3 mikrometre aralığındadır. Dolayısyla HEPA filtreler etkili bir bakteriyel filtrasyon yapabilmektedir. HEPA filtrelerin standart kullanım ömürleri 1 senedir ve bu periyotta düzenli olarak değişimi gerekmektedir.

VOC filtreleri: İçlerinde  “aktive edilmiş karbon” olarak tanımlanan toz halinde kömür ve hindistan cevizi tozu içeren filtrelerdir. Tüp bebek laboratuvarları içerisinde kullanılmak için özel üretilmiş hava temizleme cihazlarında ve inkübatör gaz hatlarının filtrasyonunda hem ortamdaki partikülleri temizlemek için HEPA filtreleri hem de aktfi karbon ve hindistan cevizi filtreleri beraber kullanılmaktdır. Buna ek olarak filtrelenen havadaki bakterileri de öldürücü etkisi olan UV lambalar içeren cihazlarda mevcuttur. Laboratuvarımızda bu özellikte hava temizleme cihazları kullanılmaktadır.

Bahsedilen filtreleme ekipmanları efektif olarak kullanılıyor olsa da kalite güvence için laboratuvar hava kalitesinin düzenli olarak ölçümü şarttır. Bu amaçla laboratuvarımızda aşağıda belirtilen parametreler 3’er aylık periyotlarda özel cihazlarla ölçülmektedir;

  • Partikül sayımı
  • VOC ölçümü
  • HEPA filtrelerin akış hızı ölçümü
  • Laboratuvar pozitif basınç ölçümü

Sterilizasyon:

Hastane ortamlarında dezenfeksiyon için kullanılan malzemeler çoğunlukla alkol, aldehidler ve anionik aktif maddeler gibi embriyolar için zararlı içeriklere sahiptir. Laboratuvar zemini, çalışma yüzeyleri, inkübatörler ve el dezenfeksiyonu için tüp bebek laboratuvarları için özel olarak üretilmiş ve embriyolar için zararsız olduğu uygun testlerle (MEA) kanıtlanmış dezenfektanlar kullanılmalıdır. Laboratuvarımızda bu özellikte dezenfektanlar kullanılmaktadır.

Yüzey sıcaklıkları:

Embriyoloji laboratuvarı içerisinde gamet ve embriyolar ile ilgili işlemlerin uygulandığı yüzeylerin (OPU esnasında folikül sıvılarının toplandığı tüplerin bulunduğu ısıtıcı blok, steril çalışma kabini yüzeyi, inverted mikroskop yüzeyi) sıcaklıkları, kültür solüsyonları içerisindeki sıcaklık 37 derece olacak şekilde ayarlanmalı ve bu şartların düzenli kontrolleri yapılmalıdır. Maalesef birçok embriyoloji laboratuvarında yapılan en büyük hata, bu yüzeylerde sıcaklık kontrolünü sağlayan elektronik cihazların göstergelerinde 37 dereceye ayarlanmasının yeterli olduğudur. Dış ortam sıcaklığı, kültür solüsyonlarının içine koyulduğu plastik malzemeleri soğutucu etki yapar ve bu nedenle doğru sıcaklık ayarı solüsyonlar içerisinde yapılacak sıcaklık ölçümleri ile belirlenmelidir. Buna göre gerçek sıcaklık, OPU tüplerinde cihaz göstergesinin 1-2 derece altında, embriyo kültürü ve mikroenjeksiyon için kullanılan kaplarda ise kullanılan malzemeye göre cihaz göstergesinin 2-4 derece altında olmaktadır. Fizyolojik seviye olan 37 derece embriyonun, protein yapısındaki ısıya hassas enzimlerin büyük rol oynadığı metabolik faaliyetlerinin düzgün yürütülmesi ve mikrotübül adı verilen, hücre iskeletini oluşturan, hücre içinde taşıma faaliyetlerini ve en önemlisi hücre bölünmesini yöneten protein yapılarının da düzenli faaliyeti açısından hayati önemdedir. Bu sıcaklık aynı zamanda pH seviyesinin sabitlenmesi açısından da önemlidir.

Özellikle yumurtalar için sıcaklık ayrı bir öneme sahiptir. Embriyolar heat-shock protein olarak tanımlanan, sıcaklık değişimlerini belli oranlarda tolere edebilen sistemlere sahipken, yumurtalarda bu sistem henüz aktif değildir. Mayoz bölünmenin ikinci aşamasında, metafaz II olarak tanımlanan seviyede bulunan olgun yumurtalarda, sitoplazma içerisinde kromozomlar, metafaz plağı olarak adlandırılan yapı içerisinde mikrotübül olarak adlandırılan tesbih boncuklarına benzer protein yapıları tarafından karşılıklı olarak uygun pozisyonlarda sabitlenirler. 35 derecenin altında sıcaklıklarda bu yapılar dağılır ve sıcaklık normale döndüğünde tekrar birleşirler. Fakat bu durumda kromozom eşleşmelerinde düzensizlikler oluşabilir ve bu durum ileri embriyonik gelişimde anöploidiye (sayısal ve yapısal kromozom anormallikleri) sebep olabilir.

Laboratuvarımızda tüm sıcaklık kontrollü yüzeylerin sıcaklıkları, embriyoloji laboratuvarı için özel üretilen ve çok küçük hacimde kültür solüsyonu damlacıkları içerisinde (5-10 mikrolitre) ölçüm yapmaya elverişli boyutta sıcaklık probuna sahip yüksek hassasiyette(±0.2 derece) termometreler ile günlük olarak ölçülmektedir.